共聚焦和多光子显微镜
CLSM-FLIM 和 MP-LSM FLIM 都广泛用于应用科学，以研究生物学和材料。共焦成像方法使用针孔（小光圈）来拒绝离焦光。大多数生物医学共焦系统使用低功率激光进行激发，并使用一对电流扫描仪（XY 扫描仪）将光聚焦在空间中的一个点。物镜控制的精确移动位置。来自 3-D 焦点体积的荧光发射通过 XY 扫描仪返回（因此被取消扫描）并到达检测器。聚焦点在样品上扫描以逐个像素地检测光子密度。计算机记录光子密度（即荧光强度）以及 XY 扫描仪的位置和位置以生成 CLSM 图像。LSM 和 CLSM 之间的区别在于使用 CLSM 中的针孔，可以实现轴向（-平面）选择。CLSM 的综合评论可在其他地方获得。150 – 152
Multiphoton FLIM采用MPE，一般为双光子（2P）或三光子（3P）激发，依靠高光子密度实现荧光的非线性激发。这种高密度是通过近红外区域中较低能量、较高波长的光子实现的。在 2P 激发中，两个能量一半的光子自发地聚集在一起，将分子激发到更高的电子能级，然后遵循其规则的辐射衰减（荧光）路线松弛回到基态。多光子 FLIM 广泛用于组织成像，因为与单光子激发中常用的可见波长相比，近红外波长在组织中实现了更深的穿透深度。这是由于在近红外波长窗口内组织中的散射和吸收减少。MPE 的非线性激发方案将荧光激发限制为与共焦检测体积相当的小焦距体积，但没有针孔。这允许将 MP-LSM 探测器置于透射模式（或非解扫描模式），而不是通过扫描光学器件进行解扫描。这种非去扫描几何结构可实现更高的检测效率。多光子系统使用可调谐锁模激光器，提供超短、高强度脉冲。一种流行的光源是可调谐范围在 680 到 1100 nm 之间的钛蓝宝石晶体激光器。大多数 MP-LSM 系统包括脉冲源以实现高光子密度，因此额外的 FLIM 功能只需要定时电子设备来估计光子到达时间。因此，许多 MP-LSM 系统可能包括 FLIM、与传统上使用连续波激发源的 CLSM 系统不同。MP-LSM 系统通常收集比 CLSM 更深的 3-D 图像断层扫描图像。MP-LSM 的评论可从参考文献中获得。 152至156。
多个荧光团的同时激发优于顺序成像，因为它最大限度地减少了 FLIM 采集时间。除了二次谐波生成 (SHG) 信号之外，三个内源性荧光团的同时 FLIM 已通过多光子波长混合实现。6此外，一种波长已用于激发两种固有荧光团 NAD(P)H 和 FAD。157此外，两个单光子波长在时间上交错以交替激发 NAD(P)H 和 FAD。
