显微镜物镜和目镜
复合光学显微镜必须配备最高质量的光学器件（物镜和目镜），必须精确对准，并且必须安装适当的滤光片以观察和记录来自研究对象的所有相关信息。校准显微镜所需的步骤在相应显微镜制造商提供的详细手册和人类遗传学当前协议的附录 3N 中进行了概述。正确对齐的重要性怎么强调都不为过。The ACT Cytogenetics Laboratory Manual ( Barch et al., 1997 ) 和Human Cytogenetics: A Practical Approach ( Rooney and Czepulkowski, 1992 )中对显微镜和摄影进行了精彩的讨论）。这两篇参考文献都是细胞遗传学实验室的宝贵资源。高质量的物镜对于在生物标本研究中获得最大信息至关重要。镜头会聚光并放大图像。物镜系统必须具有高分辨率和对镜头像差的校正。镜头的分辨能力R定义为两个发光点可以分开并且仍然可以使用该物镜识别为不同物体的最小距离。R由光学衍射理论描述为：
R = 1.22 λ /(2 × NA)
其中λ等于入射光的波长，NA 是数值孔径，它是在固定物镜距离处进入物镜的光锥的量度（James 和 Tanke，1991 年；Rawlins，1992 年）。NA 的值由下式给出：
NA = n sin α
其中n等于物镜和样品之间介质的折射率，α等于光锥垂直角的一半（图 4.4.2）。由于技术原因，玻璃物镜和油浸介质（折射率为 1.515）的 NA 被限制在 1.35 至 1.40 的最大值，并且通常显示在物镜的侧面。高数值孔径导致最小的横向分辨率、最小的轴向分辨率和最大的光子捕获。这在荧光显微镜中尤为重要，因为荧光显微镜的发射光量通常非常小。捕获光的亮度受许多不同参数的影响，包括荧光团的浓度、通过光学器件的光透射、总放大倍率和物镜的数值孔径（以及聚光镜，在透射荧光的情况下） ）。落射荧光显微镜中的相对图像亮度由以下等式给出：
B = (NA obj ) 4 Mag 2
当物镜和盖玻片之间的所谓“物空间”包含空气时（如“干”物镜），数值孔径不能超过 0.95。然而，当在两个表面之间使用折射率为 1.515 的浸油时，可以获得 1.35 至 1.40 的 NA。这是因为油的折射率与载玻片、盖玻片和物镜的折射率相同。这可以防止光在从样品穿过这些其他材料时被折射。浸没介质包括各种天然和合成油（具有不同的n值）、水 ( n = 1.333) 和甘油 ( n =100% 甘油为 1.466，40% 甘油：60% 水为 1.391，23°C）。浸入式物镜通常是为使用特定类型的浸入式介质而生产的，并在物镜侧面进行了标记；“干”物镜不能用作浸没物镜。荧光显微镜需要低荧光的浸油，物镜制造商可以帮助获得合适的类型。
图 4.4.2
数值孔径的图解说明。随着α接近 90°，sin α接近 1.0。样品和物镜之间的介质的折射率被指定为n。
除了作为放大倍率和数值孔径函数的分辨率之外，现代光学显微镜物镜还必须纠正球差和色差问题。球面像差是由于透镜的曲面未能将通过透镜的所有光线引导到同一焦点而产生的。不正确厚度的盖玻片或折射率不匹配（即错误的浸油）也会导致球面像差和无法聚焦。早期的显微镜（单镜头或复合镜头）由于色差而损失精细细节，导致小物体周围出现色环。穿过镜头的白光被分解成其组成颜色。不同的波长被衍射到不同的程度，因此具有不同的焦点。卡皮察，1996 年；井上和春天，1997）。消色差物镜相当简单，因为针对光谱的中间范围校正了球面像差，从而将所有分解的波长引导到同一焦点。平面消色差物镜比普通消色差物镜更复杂，并且具有场曲像差较小的优点。当通过物镜外围的光比通过中心的光更靠近镜头的后焦平面聚焦时，会引起场曲。结果是视场中心和外围之间的焦平面存在差异。平面复消色差物镜是昂贵、复杂的平场物镜，可为色差和球面像差提供最大的校正。物镜提供的校正类型也显示在其侧面。在过去，深紫外激发需要萤石（合成石英）和平面萤石透镜，例如，对于 Fura-2 的 340 nm 激发，因为复消色差透镜具有许多紫外吸收玻璃组件。现代（1997 年后）平复消色差透镜通常（但并非总是）将光透射到 300 nm。如果这可能很重要，例如 Fura-2，或者要真正最大化量子点激发，则应从制造商处获得透射曲线，或者应在实验室中测试多个透镜。随着生物学家扩展他们所需的调色板，他们希望使用显微镜对来自紫外线的标本进行成像（但并非总是如此，将光传输到 300 nm。如果这可能很重要，例如 Fura-2，或者要真正最大化量子点激发，则应从制造商处获得透射曲线，或者应在实验室中测试多个透镜。随着生物学家扩展他们所需的调色板，他们希望使用显微镜对来自紫外线的标本进行成像（但并非总是如此，将光传输到 300 nm。如果这可能很重要，例如 Fura-2，或者要真正最大化量子点激发，则应从制造商处获得透射曲线，或者应在实验室中测试多个透镜。随着生物学家扩展他们所需的调色板，他们希望使用显微镜对来自紫外线的标本进行成像（< 380 nm）到近红外（Cy5.5、Cy7、NIR 量子点等）和用紫外（例如，337-nm 氮激光切割）激发到近红外（双光子和三光子激发，600到 1200 nm) 激光，人们发现复消色差通常仅表示可见光。制造商开始提供与目前扩展调色板相匹配的镜片。添加特殊附件，例如 OptiGrid（Thales Optem，http://www.thales-optem.com）或 Apotome（蔡司），将网格图案（放置在落射照明场孔径处）投射到样品上，快速揭示当前研究的大多数落射照明光列车是如何无色的。
