当代显微镜的趋势

在生物医学领域，生物样本的成像长期以来一直是一项支柱技术，不仅加深了我们对基础生物学的理解，而且在设计对抗感染和疾病的策略和疗法方面也发挥着关键作用……

显微镜在历史上是二维的，但我们周围的世界不是。我们想更多地了解我们的样本，在所有三个维度上都具有高分辨率，并且随着时间的推移（第四维度），如果样本是活的。在未来几年，我们预计 3D 显微镜需求将出现重大技术发展。与此同时，超声断层扫描、显微CT和正电子发射断层扫描等非显微镜3D成像方法的分辨率也无疑会有所提高，从而缩小这些技术与光学显微镜的分辨率差距。

在光学显微镜中，穿过 5 微米厚的样本（例如组织或细胞层）的光束可以揭示有关样本的大量信息。但是，我们还不能检测所有细节并正确量化它们。尽管研究人员可以通过简单地滚动多个焦平面来了解有关样本的很多信息，但无法轻松捕获和解释高分辨率（亚细胞）下所有维度的综合图片。取而代之的是，通常会获取几个单一的焦平面图像，随着样本厚度的增加，每个图像的“模糊”也会增加，这是由于失焦信息主导图像的结果。借助电动聚焦和图像反卷积算法，可以计算每个平面的聚焦分量，

所需的 3D 信息可以从多个物理或光学串行部分集成。对于物理切片，每个切片都需要单独收集和单独成像，结果会补偿缺失的切片、压缩区域和意外的样品旋转、倾斜或扭曲。然后整个卷在 silico中渲染。具有高处理能力和专业软件的计算机最近赋予了我们执行此类任务的能力，再次增强了我们向令人满意的 3D 成像迈进的能力。

另一个问题是确定所需的分析体积和 XYZ 分辨率之间的最佳折衷。对于大面积的高 XY 分辨率，可以使用电动载物台在高倍率下进行 XY 扫描。这不再代表技术挑战，因为在此类应用中通常使用干式物镜。尽管油浸式镜头通常提供更高的分辨率，但传统的矿物油并不能均匀地散布在大样品周围。最近，硅油和水浸透镜已经上市，从而减少了这种限制的影响。

但是，各种软件算法准确“缝合”大量图像的能力存在差异。然而，可以在几分钟内完成对大小为几 cm ²的样本的单次扫描。Z 分辨率将由截面的厚度定义。

3D 显微镜的最终目标——在每个方向上获得相同的高分辨率——在理论上是可以实现的；但是，如果样本量很大，这仍然是一项具有挑战性的任务。例如，在单个实验中，一个 1cm ³组织样本必须以 500nm 步长连续成像，需要 20,000 个切片，每个切片都必须收集、染色和成像。因此自动化是必不可少的。与收集连续切片相比，更有希望的解决方案是将块面成像与连续块剃须相结合。这种方法的明显优势是串行图像的完美对齐。缺点在于难以标记或染色整个组织块。为了克服这一点，可以在样品准备成像之前使用自发荧光或将荧光标记引入样品。在任何一种情况下，都不需要后标记，这在厚样品中总是很困难的。