荧光显微镜-定义、原理、部件、用途
荧光显微镜定义
甲荧光显微镜是光学显微镜，使用荧光和磷光而不是，或者除了，反射和吸收到的有机或无机物质的研究的特性。
荧光是吸收光或其他电磁辐射的物质发出的光，而磷光是与荧光相关的特定类型的光致发光。
与荧光不同，磷光材料不会立即重新发射它吸收的辐射。
荧光显微镜是在 20 世纪早期由 August Köhler、Carl Reichert 和 Heinrich Lehmann 等人设计的。
荧光显微镜原理
大多数细胞成分是无色的，在显微镜下无法清楚地区分。荧光显微镜的基本前提是用染料对组分进行染色。
荧光染料，也称为荧光团或荧光染料，是吸收给定波长（通常为 UV）的激发光并在短暂延迟后发射更长波长的光的分子。吸收和发射之间的延迟可以忽略不计，通常在纳秒级。
然后可以从激发光中过滤发射光以揭示荧光团的位置。
荧光显微镜使用强度高得多的光来照亮样品。这种光激发样品中的荧光物质，然后发出更长波长的光。
生成的图像基于第二个光源或荧光物质的发射波长，而不是最初用于照亮和激发样品的光。
在职的
激发波长的光通过物镜聚焦在样品上。样品发出的荧光由物镜聚焦在检测器上。由于大部分激发光通过样品传输，因此只有反射的激发光与发射光一起到达物镜。
形式
“荧光显微镜”是指任何使用荧光产生图像的显微镜，无论是像落射荧光显微镜这样的更简单的设置，还是像共焦显微镜这样更复杂的设计，它使用光学切片来获得更好的分辨率。荧光图像。
大多数使用的荧光显微镜是落射荧光显微镜，其中荧光团的激发和荧光的检测是通过相同的光路（即通过物镜）完成的。
荧光显微镜零件
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荧光显微镜的典型组件是：
荧光染料（Fluorophore）
荧光团是一种荧光化合物，可以在光激发时重新发光。
荧光团通常包含几个组合的芳族基团，或带有几个 π 键的平面或环状分子。
许多荧光染料是为一系列生物分子设计的。
其中一些是固有荧光并结合感兴趣的生物分子的小分子。这些的主要例子是核酸染色剂，如 DAPI 和 Hoechst，鬼笔环肽用于染色哺乳动物细胞中的肌动蛋白纤维。
一个光源
使用四种主要类型的光源，包括氙弧灯或带有激发滤光片的汞蒸气灯、激光器和高功率 LED。
激光器主要用于复杂的荧光显微镜技术，而氙灯、汞灯和带有二向色激发滤光片的 LED 常用于宽视场落射荧光显微镜。
励磁过滤器
激发器通常是一个带通滤波器，它只让荧光团吸收的波长通过，从而最大限度地减少其他荧光源的激发并阻止荧光发射带中的激发光。
分色镜
二向色滤光片或薄膜滤光片是一种非常精确的滤色片，用于选择性地通过小范围颜色的光，同时反射其他颜色。
排放过滤器。
发射器通常是一个带通滤波器，它只让荧光团发射的波长通过，并阻挡该波段之外的所有不需要的光——尤其是激发光。
通过阻止不需要的激发能量（包括紫外线和红外线）或样品和系统自发荧光，滤光片确保最暗的背景。
荧光显微镜的应用
鉴定固定和活生物样品中的结构。
荧光显微镜是当今生命科学研究的常用工具，因为它允许使用多色染色、标记细胞内的结构以及测量细胞的生理状态。
荧光显微镜的优点
荧光显微镜是研究活细胞成像中表现出的动态行为的最流行的方法。
这源于它能够在非荧光材料中以高度的特异性分离单个蛋白质。
灵敏度足够高，可以检测每立方微米少至 50 个分子。
现在可以用不同的颜色对不同的分子进行染色，从而可以同时跟踪多种类型的分子。
这些因素相结合，使荧光显微镜在体外和体内成像方面比其他光学成像技术具有明显的优势。
荧光显微镜的局限性
当荧光团在称为光漂白的过程中被照亮时，它们会失去发出荧光的能力。当荧光分子积累来自荧光期间激发的电子的化学损伤时，就会发生光漂白。
细胞对光毒性敏感，尤其是短波长光。此外，荧光分子在光照下有产生活性化学物质的倾向，这增强了光毒性作用。
与透射和反射光显微技术不同，荧光显微技术仅允许观察已标记为荧光的特定结构。
