关键超分辨率技术的简要概述

STED 是一种基于共焦激光扫描的技术，通过添加高功率环形 STED 激光器实现超分辨率。STED 激光器与激发光束对齐并耗尽重叠区域中荧光分子的发射。这种耗尽是通过中断激发电子所经历的内部转换过程来实现的，高能耗尽激光迫使激发的荧光分子立即返回基态。这导致释放出一个波长等于所用耗尽激光波长的光子，该光子很容易用滤光片去除。STED 最初是使用双光子激光器进行耗尽，但现在商业上通常使用连续波 (CW) 激光器或具有更长脉冲长度的脉冲激光器来实现。。CW耗尽激光器通过消除对激光脉冲同步的需要简化了实施; 然而，这会导致样品在激发脉冲之间暴露于 STED 光束，当它无助于图像形成时，会增加光漂白。与脉冲 STED 不同，在脉冲 STED 中，所有消耗光子在样品激发后不久到达，CW 实施会遇到额外的问题，即瞬时 STED 强度较低，这意味着更多的分子没有暴露于足够的 STED 光子以被耗尽，从而降低了可达到的解决 。这导致了时间门控 STED，其中短寿命发射的光子被时间门控移除，因为它们不太可能有足够的机会经历 STED。。脉冲实现也受益于时间门控。与最初使用的皮秒或飞秒 2 光子激光器相比，商业脉冲系统使用脉冲长度约为 1 ns 的 STED 激光器。更长的脉冲长度允许激光功率在更长的持续时间内传播，从而减少光漂白，并且还可以克服用较短脉冲长度观察到的问题，包括极化效应 和激光同步抖动 。脉冲长度较长时 STED 效率略低，但通过使用时间门控可以消除这种降低。

样品中的细节被显微镜检测为不同频率的光波的组合。然而，显微镜光学系统固有地限制了它们可以采样的频率，这意味着最高频率的信息（即，样本中最高分辨率的细节）丢失。SIM 技术利用了一种称为莫尔效应的现象，即两种不同的高频模式在叠加时的干扰将产生频率之和（非常高）和频率之间的差异（低）。因此，通过使用略低于显微镜衍射极限的照明图案，可以将样品中的高频信息移动到显微镜的采样范围内。通过控制照明图案的方向和相位，可以从检测到的图像中反算出原始的高频信息。为了实现完整的重建，需要收集具有不同位置和方向的照明模式的多个图像，以重建最终的 SIM 图像